Луки, где его стали готовить к службе при алтаре: он учил молитв, пел в хоре, , звонил в колокольчик... Поначалу Джонни был горд своими успехами на этом поприще, но вскоре осознал, что церковь - не его место. Джон-подросток был по-своему очень религиозен, но отказался принять официальную догматику католической церкви: он не выносил ни малейшего стеснения своей свободы, всегда отстаивал право на самостоятельное мышление. По просьбе Джона родители забрали его из школы Св. Луки и перевели в академическую школу в его родном городе Сент-Пол. В 1933 году он успешно сдал экзамены в Калифорнийский технологический институт.

Курс общей биологии вел знаменитый профессор Т.Морган; под его руководством Джон с увлечением занимался эмбриологией и генетикой. Его заинтересовали проблемы возникновения и развития жизни, разума. Окончив институт, он поступил в одну из высших медицинских школ, где изучил анатомию и физиологию мозга.

В годы второй мировой войны Джон участвовал в создании аппаратуры для исследования физиологического состояния военных летчиков в высотных полетах. Он разработал технику непрерывной записи параметров дыхания и артериального давления и химического анализа выдыхаемого воздуха в условиях полета. Работа, весьма ценная для военной медицины, стала для Лилли неплохой экспериментальной школой.

После войны он начал собственные исследования электрической активности мозга: освоил методику вживления тончайших электродов в мозг кошек, собак, обезьян, стараясь как можно меньше травмировать животных. Воздействуя током на различные мозговые структуры, он наблюдал изменения поведения.

Большим научным достижением было обнаружение мозговых центров, ответственных у животных за чувства боли, страха, гнева, удовольствия. Давая обезьянам возможность самим включать и выключать сигнал, Лилли исследовал особенности поведения при стимуляции "положительных" и "отрицательных" зон мозга.