По словам Вазари, художник приглашал, во время позирования Моны Лизы, людей, игравших на лире и певших, и постоянно держал шутов, призванных развлекать ее, чтобы этим способом устранить меланхоличность, свойственную обыкновенно живописным портретам. С помощью таких мер Леонардо стремился вызвать на лице своей модели ту улыбку, которую он и запечатлел в своем произведении. Подобно пропорциям леонардовских фигур, эта улыбка построена на глубоком знании строения человеческого лица и на строгом учете индивидуальной выразительности его отдельных частей.

«Сложный полуфантастический пейзаж тонко гармонирует с характером и интеллектом портретируемой. Кажется, что зыбкая изменчивость самой жизни ощущается в выражении ее лица, оживленного едва уловимой улыбкой, в ее спокойно-уверенном, проницательном взгляде. Лицо и холеные руки патрицианки написаны с удивительной бережностью, мягкостью. Тончайшая, словно тающая, дымка светотени (так называемое сфумато), окутывая фигуру, смягчает контуры и тени; в картине нет ни одного резкого мазка или угловатого контура» (М.Т. Кузьмина).

Весной 1506 года Леонардо уезжает в Милан, где с небольшими перерывами остается до 1513 года. Он по-прежнему интересуется научными проблемами, совмещая занятия наукой с деятельностью художника. В 1508–1512 годах Леонардо работал над памятником маршалу Тривульцио.

Во время пребывания во Флоренции в 1510 году мастер пишет «Святую Анну с Марией и младенцем Христом». Внутреннее излучение, непостижимая гармония спокойного достоинства и оживленной мимики и поз персонажей создают неповторимое очарование картины. Впечатление усиливает пейзаж, представляющий особый синтез подлунного мира с элементами сверхземного пространства: Св. Анна символизирует бесконечный универсум, фигура Марии размещена в пространстве, обозначающем земную реальность.

В 1513 году Леонардо вызвал в Рим покровитель Джулио Медичи, и он оставался там до 1517 года. Затем художник отправился во Францию по приглашению короля Франциска I.