Однако все эти изменения невозможно было внедрить в серию немедленно, поэтому самолеты пошли в строевые части в комплектации, соответствующей головному серийному Пе-3. Всего в 1941 г. построили 196 Пе-3 (16 – в августе, 98 – в сентябре и 82 – в октябре). Кроме того, завод изготовил опытную машину Пе-3бис (первого варианта). В ноябре завод эвакуировался в Иркутск, поэтому вплоть до апреля 1942 г. выпуск истребителей прекратился

Изучение возможностей Пе-3 для применения в качестве ночного истребителя производилось силами Научно-испытательного полигона авиационного вооружения (НИП АВ) ВВС в начале сентября 1941 г. Летчик-испытатель Степанчонок и штурман воентехник первого ранга Нос выполнили отстрел всех огневых точек машины и убедились, что пламя выстрелов сильно слепит экипаж. Сетка прицела К8-Установилась невидимой, и огонь приходилось вести, наводя по трассе. Специалисты по вооружению отреагировали на замечания оперативно и установили на стволы пулеметов пламегасители. Повторные испытания показали, что вспышки выстрелов мешать перестали.

В ходе испытаний выявилась необходимость в ночных шторках на нижнее остекление кабины, без которых случайное попадание самолета в луч прожектора воспринималось как физический удар по глазам, которые немедленно заливало слезами, и летчик терял ориентацию. Шторки были быстро разработаны и установлены. Затем на Пе-3 опробовали (впервые в СССР) ультрафиолетовое освещение в кабине экипажа и фосфоресцирующие составы на шкалах приборов. Все нововведения были рекомендованы к внедрению в серийное производство.