Деятельность братств встречала сильную помеху в праве верховной польской власти назначать высшую православную иерархию. Между епископами, назначаемыми королем, и братствами стали все чаще происходить столкновения на почве стремлений братств контролировать и направлять деятельность епископов. Не в интересах королей, уже горячо примкнувших к католичеству после колебаний Сигизмунда Августа в половине 16-го века, было назначать лучших людей на высокие посты в православной церкви. А потому мысль о компромиссе с католическим духовенством стала распространяться не только в среде католической, но и между видными представителями еще уцелевшего кое-где православного дворянства и, наконец, среди высших православных иерархов, томившихся своим второстепенным положением в Речи Посполитой и завидовавших окруженным почетом католическим епископам. В 1595 г. галицкие и волынские архиереи приняли унию с католической церковью и признали верховное господство папы. Правда, затем часть их отреклась от унии, но было уже поздно: польский король Сигизмунд III, фанатически преданный иезуитам, считал унию делом оконченными В борьбе, вспыхнувшей на этой почве и продолжавшейся несколько десятилетий, унии удалось сделать много завоеваний. Казаки отстояли православие в Киевской земле, но в Холмщине, в белорусских землях, в Галиции некому было отстаивать православную церковь, и здесь уния восторжествовала. Центром религиозной борьбы в западной Руси становился Киев, вскоре вступивший в оживленные сношения с Москвой. Общее дело православия и борьбы с Польшей объединило Малороссию с Московским царством и привело к их политическому союзу в 1654 г.

Пробует восстать во имя своей национальной жизни и западная Русь, Галиция, Волынь и Подолия, но здесь движение оказалось слишком слабо и, неподдержанное Богданом Хмельницким, замерло.