Главными причинами конфликта, зревшего еще до распада СССР, явился, с одной стороны, рост националистических настроений в Молдове, с другой стороны — сепаратистские устремления руководства находящегося на территории Молдовы никем не признанного самопровозглашенного государственного образования — так называемой Приднестровской Молдавской Республики (ПМР). Конфликт имел и экономические предпосылки: на территории Приднестровья была сосредоточена большая часть промышленных предприятий Молдовы.

Рост молдавского национализма подогревался тем, что сформированному в мае 1989 года Народному фронту Молдовы (НФМ) удалось в процессе выборов провести своих сторонников в Верховный Совет Молдавской ССР. Представители НФМ сформировали мононациональное руководство республики, а всем основным положениям своей программы придали форму закона. Идеологи НФМ стремились обеспечить, с их точки зрения, более справедливый режим учета национальных интересов молдавской нации, что привело к фактам дискриминации по отношению к национальным меньшинствам и столкновениям на этнической почве. При этом к началу конфликта на территории Молдовы проживали 65 % молдаван, 14 % украинцев и 13 % русских (по данным переписи 2004 года, на территории республики помимо молдаван (75,8 %) проживают украинцы (8,4 %), русские (5,9 %), гагаузы (4,4 %) и др).

Дискриминация выразилась, в частности, в языковой политике нового молдавского руководства. Кроме того, в стране значительную популярность получили прорумынские настроения. Целью унионистов было присоединение Молдовы к Румынии. Начали раздаваться лозунги: «Румыны, объединяйтесь», «Молдавия — для молдаван» и «Русских — за Днестр, евреев — в Днестр».

Молдавские националисты сорвали военный парад 7 ноября 1989 года, а в День советской милиции предприняли попытку штурма здания республиканского МВД.