В конце XV - начале XVI веков с Кирилловым и другими заволжскими монастырями тесно связана группировка сторонников монастырского "нестяжания" (отказа от владениями селами), полагавшая, что иноки, посвятившие себя Богу, не должны пользоваться трудом чужих рук и "кормиться" собственным "рукоделием". На церковном соборе 1503 года нестяжатели потерпели поражение, однако ожесточенная борьба между враждующими партиями внутри русской церкви вокруг вопроса о монастырском землевладении еще долго не ослабевала. Хотя Кириллов монастырь, обладавший огромным вотчинным хозяйством, никогда не проводил на практике идей нестяжания, из него вышли и в нем подвизались многие крупнейшие деятели этого движения. Среди них - глава первых нестяжателей Нил Сорский, постриженик Кирилло-Белозерского монастыря. После пребывания на Афоне, где он приобрел обширные богословские звания, Нил возвратился в Белозерье и основал свой скит посреди непроходимых лесных болот, в 20 км к северу от Кириллова. Влияние проповеди Нила Сорского, видевшего в монашестве прежде всего подвиг личного нравственного совершенствования, было особенно велико среди братии северных монастырей. Один из видных нестяжателей, Гурий Тушин, некоторое время был игуменом Кирилло-Белозерского монастыря. Монастырь в ХV-ХVI веках пользовался большим влиянием, а его настоятель входил в число высших церковных иерархов.

Особо большое внимание московские правители уделяли монастырю в XVI столетии. В 1528 году великий князь Василий III ездил в далекий Кириллов монастырь с княгиней Еленой Глинской молиться о даровании наследника. Последовавшее за этим рождение сына - будущего царя Ивана Грозного - в глазах современников связывалось с заступничеством преподобного Кирилла. Известно, что Грозный на протяжении всей своей жизни питал к монастырю особое пристрастие, трижды посещал его, делал богатые вклады (только деньгами более 24 тысяч рублей). Перед смертью принимая схиму, он, как и его отец Василий III, стал пострижеником Кириллова монастыря.